免疫蛋白实验，包括ELISA、Western Blot和免疫共沉淀（Co-IP）等，是生物医学研究中常用的实验技术。
Western Blot（蛋白免疫印迹）
是一种常用于研究中分离和鉴定蛋白质的技术。它利用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 来分离指定样品中包含的各种蛋白质，然后将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 膜上，接下来将膜与对感目标蛋白质的特异抗体一起孵育。在洗膜过程中，未结合的抗体被洗掉，只留下与目标蛋白质结合的抗体，最后通过显影胶片或荧光扫描来检测结合的抗体。
由于抗体仅与目标蛋白质结合，因此一般只能看到一条清晰的带，条带的粗细对应于蛋白质量。通过分析特定反应的位置和强度，可以获得目标蛋白在给定细胞或组织匀浆中的表达信息。由于凝胶电泳的高分辨率和免疫的强特异性和高灵敏度，Western印迹分析可检测低至1ng的靶蛋白。该方法广泛应用于分子生物学、生物化学、免疫遗传学等分子生物学领域。
在操作过程中常出现的问题以及解决办法：
1. 多条带或杂带：
可能原因包括：目标蛋白具有多种修饰形式、使用多克隆抗体导致非特异性条带较多、上样量过高
解决方法：根据杂带和目标条带的距离决定是否进行裁膜处理或更换单克隆抗体，调整上样量
2. 条带不均匀或扭曲：
原因可能包括：电泳速度、电压或温度过高导致胶变形，凝胶和玻璃挡板底部的气泡等
解决方法：减慢电泳速度，在冷室中电泳或调整pH值，充分混合并排除气泡
3. 膜上出现黑点或黑斑：
可能原因包括：膜处理不当、封闭剂与抗体之间的交叉反应。
解决方法：检查膜的处理步骤，更换封闭剂种类。
ELISA（酶联免疫吸附测定）
是酶免疫测定技术中应用最广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
在操作过程中常出现的问题以及解决办法：
1. 标准曲线问题：
问题：标准曲线显色过强或线性不佳。
解决办法：确保标准品完全溶解并充分混合，调整捕获抗体和检测抗体的比例。
2. 显色不全或花板现象：
问题：显色不全或整个板呈现阳性OD值。
解决办法：确保底物溶液新鲜且正确混合，避免底物溶液变蓝或沉淀。
3. 吸光度值异常：
问题：吸光度值偏高或低，或者吸光度不一致。
解决办法：重新评估测定方法，调整稀释度，确保移液器正常工作和校准，充分混合试剂和样品。
免疫共沉淀（Co-IP）
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
在操作过程中常出现的问题以及解决办法：
1．裂解液的选择：裂解液中的去垢剂浓度过高或配方过于剧烈可能导致目标蛋白无法被有效释放。在这种情况下，降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类可能有助于改善结果。
2．抗体的选择：选择合适的抗体是Co-IP成功的关键。建议使用先前已被证明可以沉淀目标蛋白的抗体，并尽量选择多克隆抗体，因为它们可以在多个位点结合目标蛋白，从而增加捕获成功率
3．样品制备：样品制备过程中，细胞裂解缓冲液的选择非常重要。对于可溶性蛋白，通常使用非去污剂、低盐裂解缓冲液；而对于不太可溶的蛋白复合物，则可能需要使用含有非离子去污剂如NP-40或Triton X-100的裂解缓冲液
总之，免疫蛋白实验中常见的问题涉及多个方面，包括实验设计、操作步骤、试剂选择和样本处理等。了解这些问题及其解决方法对于提高实验成功率至关重要。