编者按
类器官是指由干细胞或器官祖细胞诱导分化并经体外3D环境培养的细胞簇。与传统的细胞培养相比，类器官能够自我更新和自组织，包含多种类型的器官特异性细胞，具备主要组织或器官的三维结构与生理功能，因此在长期扩增的同时也能保持稳定的基因和表型特征，在发育生物学、疾病建模、药物研发和再生医学等研究中有着广泛的应用前景。
然而大部分的类器官缺乏血管网络的支持，严重限制了其形态大小和发育状态，在这样培养条件下构建的类器官无法完全模拟人体内真实的组织器官，而目前仅有少量培养成功的血管化类器官，因此类器官的血管化仍是该领域尤待解决的重要问题之一。
今天我们来分享一篇2023年2月的综述文章——《血管化类器官的构建思路与技术挑战》，本文总结了现有的体外构建血管化类器官的技术体系，并系统论述了血管化在类器官中的作用，以期为类器官的科学研究和临床应用提供新思路。
文章题目
血管化类器官的构建思路与技术挑战
杂志：《中国比较医学杂志》
发表时间：2023年第2期|126-133
作者：孙珂; 王婷; 李静颐; 李红梅
单位：北京中医药大学生命科学学院
01、血管发生与血管生成
血管是由内膜、中膜和外膜三层结构组成，内膜主要由血管内皮细胞构成，外被平滑肌细胞和最外层的成纤维细胞、疏松结缔组织等包围，既维持了结构的稳定性，又能够调节血管的直径以适应血流的变化，是哺乳动物体内最重要和最复杂的器官之一。作为胚胎发育过程中形成的第一个功能性器官，血管形成的多功能运输网络，在组织氧合、新陈代谢和免疫监视等过程中发挥着关键作用，有助于组织器官的发育并促进其再生，以维持生命体的生长和活力。
内皮细胞是构建血管的“基石”，广泛参与到血管网络的生成中，主要包括血管发生和血管生成两个过程。血管发生是血管祖细胞或内皮母细胞经历激活、增殖、迁移、排列、管状形成、分支，聚集形成毛细血管丛的过程。该过程主要活跃在胚胎发生的第一阶段。而血管生成是现有血管形成新的毛细血管的过程，包括血管内皮细胞的激活、增殖、迁移等，在胚胎发育的后期和成年阶段占主导地位，同时伴随多种促血管生成因子、抑血管生成因子、缺氧等的刺激、多种酶的分泌，水解重构基质，最终形成丰富的管腔结构，确保胚胎的存活和发育。
Lammer等将胚胎小鼠的内胚层分离，并与不同的组织共培养，结果表明只有主动脉内皮细胞的存在才能够增强胰岛素的产生。Matsumoto等的研究显示在新生肝细胞旁有内皮细胞的标志物存在，并且促进了肝窦毛细血管和肝芽的迁移和生长，证实了内皮细胞可促进新生血管和器官的发生，尤其在器官发生早期阶段至关重要。
同样，在大脑皮层的发育中，脑部微血管内皮细胞有利于祖细胞分化为神经元，并且能够合成细胞外基质以调节神经元的迁移和血脑屏障( blood brain barrier,BBB)的建立，参与胚胎和神经干细胞的维持和更新。因此，内皮细胞和新生器官之间的这种紧密联系，也表明了其在组织和器官的成熟和图案化中起着关键性作用。
02、类器官与血管化研究
与传统的动物模型和2D细胞培养相比，自体干细胞分化的3D类器官更符合伦理要求，能够反映细胞与细胞、基质间的相互作用关系，可较为精准地模拟出人体复杂的生理病理过程。直至今日，已有诸如小肠、脑、肝、胰岛、肾、视网膜等组织的类器官构建成功，但其研究也主要集中于疾病模型的构建。
然而，目前体外开发的类器官由于缺少血液循环，营养和氧气难以到达核心部位，代谢废物持续增加，在培养后期引起广泛的细胞死亡和过早的细胞分化，其发育阶段和功能也类似于胚胎或胎儿器官而不是成人器官，缺少相关的发育信号，形态大小和成熟度严重影响了类器官的研究与应用。
为了克服这一限制，一些研究者将类器官移植到免疫缺陷的小鼠体内，发现移植后的类器官中有宿主来源的血液灌注，并且无论是类器官的大小、 成熟度还是存活时间都有了极大的改善，可见类器官的血管化可能是解决类器官中氧气和营养分布的关键，类器官中的血管系统能通过旁分泌信号传导促进类器官的成熟，但目前体外 血管化类器官构建仍存在不小的技术难度，当下不断涌现的人工构建血管化相关研究(见表 1)，为实现类器官内血管生成提供了坚实的前期基础。
图1
2. 1 脑类器官的血管化研究
人脑是生物体中结构最复杂、功能最完善的器 官之一，是中枢神经系统的主要部分，脊椎动物的中枢神经系统和血管系统发育是同步进行的，发育中的中枢神经系统不产生血管祖细胞，而未血管化的脑类器官在移植宿主的体内无法存活，因此血管化对于营养、氧气的供应及神经元的健康发育尤为重要。
目前有许多学者尝试构建血管化的人脑类器官Pham等将同一患者来源的人诱导多能干细胞 (human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)衍生的血管内皮细胞与脑类器官共培养，移植到免疫缺陷小鼠体内的当天，发现在类器官周围 有内皮细胞标志物CD31的存在，随着脑类器官在体内进一步发育成熟，荧光染色结果显示在类器官周围有连续性内生化血管网络结构的形成，并有新的血管向类器官核心部位渗透，为脑类器官血管化研究提供了产生内源性血管化全脑类器官的新方案。
Shi等在体外通过将人胚胎干细胞或hiPSCs 和人脐静脉内皮细胞 ( human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)共培养，在一定程度上诱导 HUVECs 向脑微血管内皮细胞分化，并且形成一个发育良好的网状或管状血管系统,建立的新的血管化脑类器官可在体外长时间培养(超过 200d)，移植后的脑类器 官中血管网络可和宿主的血管相连接形成新的功能性血管网络。随着类器官技术的提高和3D类血管的构建成功，除了与内皮细胞的共培养，3D类血管与其他组织的类器官共培养也逐渐引起人们的关注。
Ahn等将hiPSCs诱导分化而成的3D类血管和脑皮质类器官共培养，通过5%胎牛血清的诱导，第13天形成的脑类器官表面表达CD31，有典型的血管样结构和神经样网络存在，并且表达BBB的典型标志物，在体外可维持50d。Sun等同时将 hESCs 诱导分化为3D类血管和脑类器官，并且在3D类血管中加入特定神经营养因子，使其具有脑血管的特征，随后将二者共培养，40d后发现类器官中形成完整的血管组织，与神经组织紧密连接并形成BBB结构。
除了以上方案，部分研究者在不依赖外源性细胞的情况下构建血管化脑类器官。血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor,VEGF) 是血管发育的关键细胞外因子，可促进ESCs向内皮细胞分化并产生管状结构的组织，同时还能够培养神经元的神经突起生长和存活，引导发育中大脑的神经元迁移。Ham 等在类器官的培养中添加VEGF，结果表明VEGF在不减少胚胎神经元的情况下增强了血管内皮细胞的分化，成功构建出具有开放性血管结构的大脑类器官，测序数据也验证了该结果。
人ETS 变体2(human ETS variant 2,hETV2) 转录因子与人血管内皮细胞的形成高度相关，Cakir 等设计了一种表达 hETV2 的人类胚胎干细胞，诱导该细胞分化成为带血管蒂的人皮层脑类器官，并表达紧密连接蛋白和营养转运蛋白、跨内皮细胞电阻表达增加等BBB的特征。BBB主要由连接的内皮细胞与紧密连接蛋白 构成,是大脑和血液循环之间的一种高度选择性和动态的亲脂屏障，维持着中枢神经系统的稳态。不少学者也通过培养BBB类器官来满足对其的研究。
Hatherell 等通过使用Trans-well系统来模拟BBB，内皮细胞生长在顶膜上，星形胶质细胞加入基底膜形成共培养，然后将周细胞加入培养板中，形成三层培养，同时在培养基中补充人源血清，成功构建BBB 三维体外模型。Bergmann 等 和张雷采用类似的培养方案，将人脑内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞在低黏附的调节下共培养，可在2~3d内使其自组装成类似BBB的球体，并且可具有紧密连接蛋白、转运蛋白和药物代谢等BBB的典型功能。
2. 2 心脏类器官的血管化研究
心脏是一个中空的器官，主要由4个腔、4个瓣膜以及5根大血管构成，自身的血液供应由两条冠状动脉保证，同时心脏也是多细胞器官，主要包括心肌细胞、心脏成纤维细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞，共同协作以实现功能的正常发挥。心脏类器官的研究进展缓慢，也与其结构的复杂性相关。
(1) Filippo Buono等首次采用三培养的方案，即将不同来源的心肌细胞、人心脏微血管内皮细胞和人心脏成纤维细胞在单细胞悬浮液中按照3∶5∶2的生理细胞比例构建心脏类器官，在培养的第21天观察到有紧凑且轮廓分明的球形结构形成，呈现出较为明显的收缩活性，并且可根据人类心脏的不同发育阶段对具体的培养方案进行调整。该方案操作简便，构建的心脏类器官具有高收缩性，但就结构而言，与体内的心脏仍有较大的差异。
(2) 鉴于成纤维细胞生长因子( fibroblast growth factor, Fgf)4 和包含层粘连蛋白的细胞外基质在器官发生和心脏发育中的重要作用，Lee等将来自小鼠 ESCs 的拟胚体培养在含有Fgf4培养基的凝胶化层粘连蛋白—内膜素复合物包被的室载玻片上，培养10d后可观察到具有多个腔室结构的心脏类器官形成，伴有明显的收缩行为，并表达胚胎心脏的相关基因和结构。
(3)Han等将不同密度的心脏干细胞(cardiac stem cells,CSCs)播种在超低附着多孔 板中，培养3d后，与CSCs相比，形成的CSCs球体具备更强的分泌功能和心肌细胞分化能力以及更高的心肌细胞相关标志物的表达，将3D球体注射到大鼠的缺血心肌中，发现缺血的心肌中有明显的新生血管生成，可促进心肌修复。
2. 3 肝类器官的血管化研究
肝是人体最大的实质性脏器，由几种不同胚胎起源的细胞类型组成，包括肝细胞、胆道上皮细胞 (胆管细胞)、星状细胞、Kupffer细胞和肝窦内皮细胞，共同执行营养素和药物代谢、循环血量和免疫系统调控、生长信号通路的内分泌控制、脂质和胆固醇稳态等多重功能来维持机体稳态。
肝类器官的血管化研究大部分是与不同的内皮细胞共培养。2013年，Takebe 等在体外将 hiPSCs诱导形成的肝内胚层细胞与HUVECs、人骨髓来源的间充质干细胞共培养以自组织形成具有三维球状结构的肝芽，移植到小鼠体内48h后观察到移植的肝芽血管与宿主的血管相互连接，形成的功能性血管网络促进了肝芽的成熟,能够执行分泌蛋白质、储存糖原、药物代谢等肝特异性功能，这也是第一个从 多能干细胞中产生功能性人体器官的研究。
Pettinato 等将人脂肪微血管内皮细胞与hiPSCs诱导分化的拟胚体按照1∶ 3的比例共培养形成的肝细胞样细胞( hepatocyte-like cells,HLCs)，与单独 hiPSCs 诱导分化的HLCs相比，具备更稳定的肝功能和更高的肝细胞基因和蛋白，同时 hiPSCs分化为HLCs的能力和效率大大提高，可满足临床大量的需求。
肝祖细胞(liver progenitor cells,LPCs)位于胆道上皮内，具有产生肝细胞和胆管细胞的双电位能力，可以长期维持，不会去分化和功能丧失，肝含有高度专业化的肝血窦内皮细胞( liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)，可指导肝发育和再生,Yap 等改进培养方案,将小鼠 LPCs 与小鼠 LSECs 按 照 1 ∶ 1 的比例共培养,构建的血管化类器官具有肝 特有的血管系统,同时包含肝实质细胞和胆管细胞。
2. 4 肾类器官的血管化研究
肾通过生成尿液、排泄代谢产物、调节体液及内分泌等功能，维持机体的生理稳态。与其他器官相比，肾是高度血管化的脏器，具有最丰富和最多样化的内皮细胞群体，保障了肾的正常发育和生理功能的正常发挥。
在肾发育的早期就有血管祖细胞的存在，因此在肾类器官的培养中有内皮细胞的存在，但缺乏功能性血管网络的形成。鉴于人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)衍生的肾类器官能够自发分泌VEGF,Low等在不使用外源性 VEGFA的条件下，通过对WNT信号传导的动态调节，有效地控制了类器官内近端肾小球与远 端肾小管的相对比例，进而调控近端足细胞释放VEGFA的水平，诱导hPSCs 分化为血管化的3D类器官，其结果也表明足细胞分泌的VEGFA能够将肾发育早期的血管祖细胞催化成为更成熟的内皮细胞，形成常驻的血管网络。
2. 5 肠类器官的血管化研究
肠是指从胃幽门至肛门的消化管，哺乳动物的肠包括小肠、大肠和直肠三部分，具有消化、吸收、 免疫调节等功能，自2009年Hans Clevers研究团队首次利用小鼠LGR5+小肠干细胞在体外培养出小肠类器官以来，肠道类器官模型被广泛应用于肠道相关疾病研究领域，但现有的培养方案并不能完全概括人类天然肠道的复杂性。
Holloway等在研究中发现 hPSCs诱导分化的肠道类器官在早期阶段会大量的内源性内皮样细胞，随着时间的推移, 其数量反而逐渐减少，为了在长时间内维持并促进内皮细胞的存活,研究者改进现有方案,在培养基 中加入表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF)、 VEGF、 Fgf2、 骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein,BMP)4 等诱导和维持血管的生长因子以诱导hPSCs分化形成血管化的小肠类器官,结果也证实在新的培养体系中,内皮细胞也可长期存在。
2. 6 3D类血管与类器官的融合研究
在众多疾病当中，血管的病变会导致组织的缺血缺氧，是其重要并发症之一，同样也能导致患者的死亡。现阶段大部分血管化类器官的构建只是初步分化出一个血管样结构，甚至只是大量 2D内皮细胞的堆积，尚不能在体内重建完整的血管结构，行使血管的职能，也不能满足循环灌注的需求。
基于此，英属哥伦比亚大学Wimmer等先把iPSCs诱导分化为血管内皮细胞，随后在3D环境中继续培养，使原本没有结构可言的2D细胞层形成具有类血管结构的3D类血管组织，首次实现了将iPSCs成功诱导为3D血管。这些类血管包含内皮 细胞、周细胞及毛细血管网络,甚至在分子水平上 与人类毛细血管相似，并在移植到小鼠体内后发现，这些类血管能够发育成包含毛细血管、静脉和动脉的完整的血管系统，可以充分模拟人类血管的结构与功能，而暴露在疾病环境中时，这些类血管也能够出现与疾病患者的血管相类似的病变特征，这意味着该类血管可模拟正常与病理情况的血管 状况,为血管疾病提供了高水平的细胞模型 。
03、基于微流控的血管化类器官技术优化
随着科技的进步和类器官的发展，现有的血管化类器官构建方案的缺陷也逐渐暴露出来，目前血管化的类器官制备方案主要集中于和不同的内皮细胞共培养研究。然而，用于共培养的内皮细胞大部分缺乏与其他体细胞相互作用的能力，难以反映和用于体内内皮细胞与周围细胞的互相作用及相关机制研究。
此外，仅凭借单独的内皮细胞，难以形成由多种细胞构成的完整的血管结构，并且缺乏动 态的灌流培养，无法模拟体内血流对血管的冲击，反映血流动力学对组织器官的作用。
在培养过程中，类器官的形态不等、大小不一，可重复性差，也存在培养成功率较低、成本高昂等问题，给血管化类器官的培养和标准化带来了挑战。有部分学者在由iPSCs诱导分化的心脏类器官中，通过3D打印技术将血管网络打印其中，构建出的心脏类器官可实现长时间的灌注，但其收缩力与体内的心脏相比差距过大，还需进一步的技术优化。
基于此，现有的血管化类器官制备中也有将3D类血管与其他类器官共培养，管解离成团块与大脑皮质类器官共培养，发现3D类血管产生的血管细胞能够穿透脑类器官，形成神经特异性血管网络，并可长期维持；Sun等将3D类血管和脑类器官共培养，同样在融合后的组织中发现有类似于BBB的结构。
但在目前的研究中，3D类血管仅限于与脑类器官进行共培养，并且尚未进行血液灌注的研究，也难以模拟血管环境，同时在所有组织类器官(包括3D类血管)的培养过程中，尚未有标准化培养体系，可重复性低；在所有的共培养体系中，从不同胚层衍生的3D类血管和其他类器官的融合仍有一定难度，仍需要进一步的探索。
而微流控体系能够模拟动态灌流，将微流控技术与3D类血管相结合，在有血管结构的基础上，辅以灌注功能，充分模拟真实的血液灌注，为上述问题的解决带来希望。微流控技术是集工程学、生物学、医学等多学科为一体的新型技术，将研究样本通过多重单元技艺集中于整体可控的微米尺寸芯片上，辅以流体的冲刷作用，完成培养和分析全过程，在构建复杂精确的组织器官等领域有着广大的应用前景。流体在微流控通道中存在的层流现象，可实现材料、化学环境和细胞在通道中的有序排布。
基于微流控技术构建的血管化类器官系统，可满足灌流培养对内皮细胞的作用，促进多种细胞因子的分泌与释放，实现在不同流速下的同时灌流，充分模拟体内的不同类型血管和不同生理、病理条件下血管中的血流关键特征，与实际的器官组织更为接近。
直至目前，已有部分学者进行了类器官与微流控技术相结合的研究:
(1)肾类器官中血管的发育在静态培养中受到限制，因此Homan等将被细胞外基质包裹的发育中的肾类器官，置于可灌注的微流控芯片上，通过高流体剪切力，逐渐发育成熟，成功构建出具有壁细胞支持的可灌注管腔的肾类器官。
与静态对照相比，流动培养的血管化肾类器官具有更多成熟的足细胞和肾小管区室、更高的细胞极性和成体基因表达，强调了流体剪切力是体外肾类器官血管形成的关键因素。
(2)为了构建更贴近生理状态的肝模型对中药注射液进行肝毒性评估，朱丽颖等采用可长期培养并模拟血管内皮剪切力的HUVECs来模拟血管。通过微流控技术模拟血液流动的力学微环境，并结合3D打印技术构建出的肝微球，成功构建出功能性血管化的人源肝类器官，并且通过该模型为3种活血化瘀中药注射剂提供了更为准确的肝毒性评价，实现药物的高通量筛选和数据处理。
(3) 杨雅敏等等基于微流控技术创建出深度为100μm、宽度为0. 079~0. 593 mm的3D微血管模型，不仅具备扩张、囊状、曲折、 分支不规律、直径不均匀等血管特征，而且将10%兔红细胞溶液注射入芯片中，结合激光散斑血流成像系统，可观察到溶液的流速分布随着血管的粗细、曲折、密度不同而发生变化，满足多种研究的需求。
(4) Ronaldson-Bouchard等开发了一种即插即用、只有显微镜载玻片大小的多器官芯片，将成熟的人类心脏、肝、骨骼、皮肤组织通过血管流动和循环免疫细胞相连，在体外再现了相互依赖的器官功能。
04、血管化类器官存在的问题与展望
类器官的血管化一直是再生医学领域研究的热点与难点，尽管近年来已取得巨大的进步,但依然有部分关键问题存在:
(1) 体外的细胞系如HUVECs依然广泛用于血管化研究，HUVECs易于处理、成本低廉，是血管化建模的首选，但人原代内皮细胞的来源有限，且难以支撑器官的特异性结构，单从制备的角度来说对血管化类器官的机制研究产生了不同程度的限制；
(2)虽然可通过微流控等工程技术构建血管化类器官，但在现有的培养方案中,血管结构的尺寸和密度与体内的血管结构相差过大，并且只能作为短期研究，在稳定性和长期性方面仍然缺乏可重复性好的技术方案。
基于上述问题，可通过结合新型3D生物打印技术，体外构建外循环系统，与类器官内部生成的血管实现端口吻合，通过AI自动化装备实现内外循环和代谢的智能化、可视化调控，有望开发出具有功能性血管网络、发育成熟的血管化类器官，助推我国医药研发和产业化进程。
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