如何挽救Western阴性结果?
Western blot是最常用的实验方法，但意义并不寻常，其结果的有无往往决定着下一步实验的走向。当您辛辛苦苦地花费近两天时间提蛋白、电泳、转印、杂交之后，显色时却得到了“白板”一块，伤心沮丧之时，千万不要轻言放弃！请务必先试试我的建议：
1. 打开冰箱，看看有没有其他显色试剂
2. 走进隔壁，换换其他实验室的成像仪器
——也许，惊喜便这样悄然而至，幸福就在那转角处！
对实验而言，幸福各有不同，而不幸往往相似。这一切都是由于那该死的“灵敏度”！
最初的沮丧和险些的错过，并不完全是您的过错。千万别被实验折磨之余，再背负太多的自责，因为原因有很多。
1. 敌人太过狡猾
您研究的对象是蛋白质，这个敌人可不简单。其表达丰度变化跨度极大，据估计有106之巨。不仅如此，真正执行功能的蛋白，其表达量往往极微，些许的丰度变化就能带来生命现象的斗转星移。面对这样的复杂而狡猾的蛋白质，我们却罕有大规模杀伤性武器，既没有PCR般的扩增技术，也没有成熟的测序方法。无奈，依靠印迹这个还算特异性好的常规武器，其杀伤力又往往受制于仪器和试剂。
2. 试剂良莠不齐
说到试剂，国产、进口，那叫一个林林种种，价格差别也很大。很多实验室老板“买得起马，配不起鞍”，最终选择便宜的试剂，当然，并不是便宜没好货，只是更多的时候，是一分钱一分货。殊不知这一省，就省掉了一两个数量级的灵敏度差异。
3. 仪器表现迥异
我们科研工作者，多为生物学出身，对仪器硬件、光学电学有着天然的不亲近感。购买仪器时，更是坠入了诸多参数的谜团，面对几十项不知所云的陌生数字，最终要么是举手投降，简单地copy了其他实验室的选择；要么是眉毛胡子一把抓，本着“一个都不能少”的原则，教条地比较每一项参数，最后费尽心力地选他个所谓的“最好”。殊不知，参数有主次之分，其权重各异；即便参数相当，真真地做个对比实验，不同厂商的“最好”，也会比出个一两个数量级的灵敏度差别。因此，选择仪器时我个人认同那句话，“不认广告，认疗效”，也就是说只看关键指标，再加上实际使用效果的比较，相信错不了。
做蛋白的实验许多年，碰到过“白板”、比较过试剂，也选购过价格不菲的仪器，有些许的感受，这里和同行们做个分享。
1选个灵敏的试剂
常用的DAB、NBT/BCIP等比色法，操作虽简单，不需仪器或胶片成像，但灵敏度和动态范围实在太差。用此法得到的阴性结果，绝对还有起死回生的余地。因此，最好选择化学发光或荧光的方法。
化学发光方法是由原Amersham公司发明并引入科研的，目前已经被广为使用。化学发光的灵敏度是比色法的100-10000倍，动态范围更是宽了1-2个数量级。之后不同厂家在此领域进行研发，经过底物的改良和试剂的优化，最终在灵敏度和持续发光时间上都有了显著的改善。选择高端试剂不仅可以提高一个数量级的灵敏度，还可使一抗的使用量降低到原来的1/20。因此，在选择试剂的时候，要视情况而定，对灵敏度要求不高时，选用常规的试剂，经济实惠；但如果蛋白丰度低、一抗又极其珍贵，那就得毫不吝惜地选择高端试剂，要知道有时一抗是不可再生资源，那可是拿钱买不来的。
图1：
如果再“不差钱”，还可以选择荧光，来他个彩色Western。结果好看在其次，关键是省事儿，目标蛋白和内参的杂交同时完成、成像一步到位。当然这是要付出经济代价的，荧光试剂可比ECL试剂贵不少。
2 选个可靠的仪器
随着CCD的发展，数码相机已经走进了每个人的生活，其便捷性已经促使我们告别了胶片时代。实验室也一样，做Western不用再费事地配显影液，不用在暗室小心地摆弄曝光夹。CCD成像仪便可让一切变轻松，无需摸索曝光时间，只需把膜往里一扔，设定好时间间隔，仪器自动得到不同累计时间的图像。我们要做的只是轻松地对着电脑，选择一张不明不暗、长相漂亮的图像就ok啦。
这事说着挺美，但是也得选个可靠的仪器才能实现，其中也有不少学问。这里先跟大家解释几个概念和参数：
何为CCD？
CCD可是个关键部件，没有它根本就不会有今天的数码成像。CCD的全名叫“Charge Coupled Device”，说白了就是光信号的接收器，它能把光信号转变成电信号，最终变为我们数字化的图像。它的大小直接决定了图像的最高分辨率，也就是我们常说的几百万像素。CCD可是个值钱的部件，面积大一点，价格没准会翻一番。
CCD在成像仪中是非常重要的组成部分，在这个小小的器件上也有很大的技术革新，如让CCD像素做45度角的旋转，以便获得分辨率更好的图像等等。这类问题太专业，不是我们轻易可以理解的。因此在这个问题是，我的建议是“不求弄懂，只抓主流”，也就是认准的主流品牌，选择有研发和生产CCD能力的一线厂商的成像仪，如Fuji、Kodak。道理很简单，自己给自己用的东西，肯定是质量又好又便宜。
何为冷CCD？
实验室用相机与家用相机不同，用到的是冷CCD，也就是说需要给CCD降温到零下二三十度。这是为什么？原因有二，一是生物样本的发光量实在太少，信号太微弱，需要相对长的曝光时间；二是CCD等光电器件，都有不可避免的系统噪音，一旦曝光时间长，噪音累计起来，积少成多，会对本就微弱的样品信号造成干扰。而给CCD降温后，其系统噪音可大大降低。
何谓f 值
对这个参数的深刻认识，得益于一次采购Canon单反镜头，同一系列f1.2、f1.4、f1.8的镜头，价格分别是人民币14000、2500、700，这期间的巨大差别，当时绝对是“雷到”我了。回来后好好研究，才了解到这是一个表征镜头光圈大小的指标，f值越小则镜头光圈越大，也就是说单位时间内进光量越大，镜头进光量与f值的平方成反。举个例子，f1.2与f1.8，虽然f值只小了0.6，但是进光量面积却增加了一倍！(如图2) 所以千万别小看了这个参数，它极大地影响着成像的速度和质量，怪不得不同参数的镜头价格，一个天上、一个地下。
图2：
话说远了，回到成像仪上来。成像设备，镜头无疑是最重要的部件，而镜头的诸多参数中我认为这个最重要。因为刚才我们说到过，生物样本发光量低，为了能够检测到清晰的样品信号，我们连微小的系统噪音都得靠极端低温严加控制，那么对于最关键的采集信号的光学部件，这个参数的考量绝不能含糊！据我所知，目前化学发光成像仪最大的镜头是f0.85，对于这种常用设备，千万别忽视了这个参数，否则发生之前提到的不幸一幕就不足为奇了。
综上所述，仪器一定要重视关键指标，试剂要低端高端择情选，不能“参数”渐欲迷人眼，“价格”障目不见山。最后，祝愿大家的Western实验都能获得漂亮的可喜的结果。