宫颈癌居全球女性癌症死亡原因的第三位，在20 - 39岁女性癌症死亡原因中居第二位。宫颈癌主要有两种类型，其中宫颈鳞状细胞癌（CSCC）占90%。手术、放疗和/或化疗是临床上常用的治疗方法。越来越多的证据表明，放疗可以激活细胞毒性信号通路，促进癌细胞死亡，通常被用作CSCC的一线治疗，特别是局部晚期病例。然而，放疗的治疗效率远远低于预期，宫颈癌特异性死亡率仍然很高，大约一半的局部晚期CSCC患者在放疗后复发。因此，明确局部晚期CSCC的分子标记物，探索放疗的作用机制，对于提高局部晚期CSCC的治疗效果是必要的。单细胞核RNA测序（snRNA-SEQ）可以对随时间累积的存档冰冻组织进行分析，因此该技术可以对单个患者进行纵向分析。

snRNA-SEQ，RNA-SEQ

在本研究中，研究收集了配对的治疗前和治疗中的CSCC样本，以便对治疗相关的变化进行严格的分析。接下来，研究利用snRNA-SEQ对放疗前和放疗过程中主要细胞类型的动态变化进行了全面表征，从而阐明了与局部晚期CSCC放疗反应相关的关键因素。接下来进一步收集了一个独立的队列，并进行了大量的Bulk RNA-seq来验证snRNA - seq衍生的数据，即在局部晚期CSCC中与放疗反应显著相关的肿瘤细胞中neural-like progenitor （NRP） 程序的表达增加。这些发现能够解释放疗治疗的基本机制，还可能提供放疗反应的潜在预测生物标志物以及新的治疗靶点，可用于提高局部晚期CSCC患者对放疗的疗效。

1. 冰冻的人宫颈癌样本放疗治疗前、治疗中的snRNA-SEQ

本研究从11例患者中收集了19例新鲜冰冻样本来做单细胞核测序，为了更好的描绘治疗前和治疗中单细胞核测序的时间动态变化，本研究收集了8例患者的治疗前、中的样本。去除低质量细胞核以后，19例样本共获得105364个高质量的细胞核。通过无监督聚类构建了细胞类型图谱，并根据marker基因注释出了7种主要的细胞类型（图1a，c）。对治疗前后细胞类型进行比较，发现治疗后上皮细胞显著降低（P<0.05），B细胞显著增加（P<0.05）。考虑到抽核相比于悬液，会捕获到更多的实质细胞，所以本研究主要针对非免疫细胞进行研究。

2. 绘制放疗过程中恶性细胞的分子变化

接下来首先对所有的上皮细胞进行inferCNV分析鉴定出了恶性肿瘤细胞。然后将来自所有样本的35001个恶性细胞聚类成16个不同的亚簇（图2c），发现恶性细胞主要通过患者进行聚类（图2b）。研究发现，在T9、T12和T5亚簇内的一个细胞亚群中，含有丰富的干性相关基因的基底样（BSL）程序的表达量显著升高。相反，在T14、T10和T8亚簇的细胞中，富集了神经元发育/细胞迁移或粘附相关基因的NRP程序表达升高。接下来，研究评估来自MSig DB的hallmark基因集的表达，以确定恶性细胞的细胞状态。发现来自T14、T10和T8亚簇的细胞中血管生成途径（angiogenesis pathway）更高的表达，这有利于肿瘤的生长，同时，T9，T12，T5亚簇中与乏氧通路（hypoxia pathway）相关的基因表达量较高，与放射抗拒相关。放疗被观察到与谱系和细胞状态程序表达的显著差异有关。恶性NRP程序在治疗中的表达显著高于治疗前样本，而BSL程序的表达较低（图2f）。值得注意的是，BSL、NRP、乏氧和血管生成4种恶性程序在无应答者治疗前肿瘤的恶性细胞中高表达（图2g），这表明它们在这些细胞类型中具有治疗敏感性相关性。

3. 与放疗相关的CAF亚群

本研究捕获到了31530个癌相关成纤维细胞，并通过无监督聚类为了7个不同的cluster，包括1个抗原呈递CAF （apCAF）、2个炎症性CAF （iCAF）和4个肌纤维母细胞性CAF（myCAF）。研究观察到放疗后PI16 + iCAF （p = 0.04）的比例增加，放疗反应较好的患者apCAF （p = 0.02）数量减少（图3d）。接下来从SnRNA-SEQ的成纤维程序中挑选了4种，包括嗜神经性（NRT）、免疫调节（IMM）、肌成纤维细胞祖细胞（MYO）和粘附性成纤维细胞（ADH-F）程序用来确定这些亚群的功能表型。其中PI16 + iCAF在NRT和IMM程序中表达量最高，在MYO和ADH - F程序中表达量最低（图3e）。然后，研究试图探索炎症相关的转录状态是否与放疗疗效相关。发现，与治疗中肿瘤相比，在治疗前肿瘤的大多数CAF亚群中，炎症相关通路，如干扰素、肿瘤坏死因子和白细胞介素6的表达显著升高（图3f）。此外，来自无应答者治疗中肿瘤的CAFs比来自应答者的肿瘤具有更高的这些通路的表达水平（图3g）。它们在宫颈癌的TME中具有炎症调节作用，并与放疗疗效相关。

4. 放疗背景下的细胞间相互作用

本研究利用iTALK鉴定恶性肿瘤细胞和其他细胞类型的细胞通讯关系，研究发现了与生长因子、细胞因子和NRP基因有关的细胞相互作用的改变。在细胞因子受配体对中，CAFs在NR中显示出更多的与其他细胞类型之间的差异上调通信对（图4a）。另外与治疗前相比，在治疗过程中观察到更多的肿瘤细胞和其他细胞类型的NRP基因的配体和受体之间的相互作用（图4a）。与有反应者相比，无反应者肿瘤中NRP基因的相互作用也更多（图4b）。综上所述，本研究结果表明CAFs与肿瘤细胞之间的细胞因子和NRP相关的细胞-细胞相互作用可能参与了放疗诱导的反应，进而可能介导治疗效果。

5. NRP程序表达增加与不良结局相关

为了验证以上结果，研究收集了第二个独立的局部晚期CSCC患者队列，其中包括来自17名患者（其中14例具有匹配的治疗前和治疗中的标本），进行了bulk RNA-seq。研究利用CIBERSORTx算法对带有snRNA - seq细胞类型标签的批量表达数据进行去卷积。结果显示，snRNA-SEQ和bulk RNA-seq的结果在两个时间点均呈显著正相关（图5a）。研究进一步计算了BSL和NRP方案在恶性细胞中的表达，以及NRT和IMM方案在CAFs中的表达（图5b）。仅在2例治疗前和8例治疗中的肿瘤中成功检测到NRP的表达（图5b），表明放疗与肿瘤细胞中NRP的表达呈正相关（图5c）。值得注意的是，NRP在恶性细胞中的表达和IMM在CAFs中的表达在无应答者的肿瘤中显著高于有应答者，这一发现验证了NRP和IMM两种程序的表达与snRNA - seq获得的放疗反应之间的负相关关系。尽管研究收集了两个独立的队列，但样本量仍然有限。因此，研究利用TCGA宫颈癌数据集，在一个更大的CSCC队列中展示了患者预后与NRP和IMM表达之间的关系。Kaplan - Meier分析疾病进展时间（time to progression，TTP）和无病生存期（ disease-free survival，DFS）发现NRP和NRP + IMM高表达与较短的TTP和DFS （图5e,f）相关。还发现只有NRP的表达与总生存期相关。

6. NRP关键基因NRG1作为放射敏感性调节因子的验证

研究接下来的目的是评估NRP和IMM程序中与放疗相关的关键基因在放疗中的生物学功能。在NRP的200个基因中，发现与应答者相比，143个基因在无应答的恶性细胞中显著上调。使用小干扰RNA （small interfering RNA，siRNA）敲低CSCC细胞系SiHa中NRG1的表达（图6a）。通过细胞计数试剂盒（CCK-8）测定，NRG1敲除后细胞活力显著降低，放射治疗后下降程度更大（图6b）。与此一致，克隆形成实验表明NRG1下调后细胞集落数量减少，辐射暴露导致细胞集落数量减少更多（图6c）。接下来在队列3中探讨了NRG1表达与CSCC患者放疗反应及预后的相关性，根据免疫组化（IHC）发现治疗后以及无响应的样本中，NRG1表达量更高（图6d，e）；生存分析表明，NRG1表达水平较高的患者总生存期和无进展生存率更差（图6f）。

7. 图7 IER3作为IMM的关键基因，其功能与放疗疗效的相关性

接下来，对放疗前和放疗中的FFPE CSCC样本进行了多重免疫荧光（mIF）和IHC，以验证队列3中IMM程序中关键基因IER3的意义。首先在队列3中通过多重免疫荧光（mIF）验证了IER3在CAF中的存在（图7a）。基于mIF，IER3+ CAFs的数量在放疗后的肿瘤和无应答者中显著升高（图7b）。接下来使用IHC检测队列3中IER3的表达水平，与mIF的结果一致，IER3在放疗后的肿瘤和无应答者中显著升高（图7c,d）。生存分析表明，IER3高表达与总生存期和无进展生存期较差相关（图7e）。

参考文献：

Lei Z ,Jun M ,Di Z , et al. Single-Nucleus Transcriptome Profiling of Locally Advanced Cervical Squamous Cell Cancer Identifies Neural-Like Progenitor Program Associated with the Efficacy of Radiotherapy.[J]. Advanced science,2023.