x; box-sizing: border-box;">8,820bp
11,600bp | | 0.7 | 410bp | 660bp | 6,400bp | 8,500bp |
| 0.8 | 320bp | 530bp | 4,830bp | 6,500bp |
| 0.9 | 260bp | 440bp | 3,770bp | 5,140bp |
| 1.0 | 220bp | 370bp | 3,030bp | 4,160bp |
| 1.2 | 160bp | 275bp | 2,070bp | 2,890bp |
| 1.5 | 110bp | 190bp | 1,300bp | 1,840bp |
| 2.0 | 65bp | 120bp | 710bp | 1,040bp |
| 3.0 | 30bp | 60bp | 300bp | 460bp |
| 4.0 | 18bp | 40bp | 170bp | 260bp |
| 5.0 | 12bp | 27bp | 105bp | 165bp |
聚丙烯酰胺凝胶中，溴酚蓝和二甲苯青FF的表观分子大小
| 丙烯酰胺：bis(19:1)，凝胶（%） | 溴酚蓝 | 二甲苯青FF |
|---|
| 变性凝胶 |
| 4.0 | 50碱基 | 230碱基 |
| 5.0 | 35碱基 | 130碱基 |
| 6.0 | 26碱基 | 105碱基 |
| 8.0 | 19碱基 | 75碱基 |
| 10.0 | 12碱基 | 55碱基 |
| 15.0 | 10碱基 | 40碱基 |
| 20.0 | 8碱基 | 28碱基 |
| 30.0 | 6碱基 | 20碱基 |
| 非变性凝胶 |
| 3.5 | 100 bp | 460 bp |
| 5.0 | 65 bp | 260 bp |
| 8.0 | 45 bp | 160 bp |
| 12.0 | 20 bp | 70 bp |
| 15.0 | 15 bp | 60 bp |
| 20.0 | 12 bp | 45 bp |
Loading Buffer 常见组分举例：
10 mM Tris-HCl (pH 7.6)
60 mM EDTA
0.03% 溴酚蓝
60% 甘油
Loading Buffer 常见组分
| 产品号 | 名称 | 级别 | Cas | 规格 | 备注 |
|---|
| T105291 | 三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris HCl) | 用于分子生物学和细胞培养,≥99.0%(AT) | 1185-53-1 | 100g,500g | 盐 |
| X105504 | 二甲苯青FF | 分子生物学级 | 2650-17-1 | 5g,25g | 指示剂 |
| B109645 | 溴酚蓝 | Indicator | 115-39-9 | 10g,25g,50g | 指示剂 |
| G118851 | 甘油 | 无菌,for molecular biology | 56-81-5 | 100ml | 密度成分 |
| E118595 | 乙二胺四乙酸二钠,二水 | 分子生物学和电泳级,99% | 6381-92-6 | 100g,500g | 螯合剂 |
凝胶材质
琼脂糖和聚丙烯酰胺是核酸电泳中最常用的两种凝胶基质。两种材料都能形成三维基质，用于核酸的分离。
凝胶材质的选择，主要取决于核酸样品的大小和期望达到的分辨率。琼脂糖凝胶可用于分离0.05-50kb的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔径较小，可用于分离小于3kb的核酸分子。 某些情况下，可采用聚丙烯酰胺凝胶以获得片段小于100bp的单碱基分辨率。
琼脂糖凝胶和聚丙烯凝胶之间的差异
| | 琼脂糖 | 聚丙烯酰胺 |
|---|
| 凝胶灌制方法 | 融化和凝固 | 开始化学反应 |
| 核酸回收 | 融化和提取 | 溶解和扩散，或电解 |
| DNA分离范围 | 50-50,000 bp | 5-3,000 bp |
| 分辨力 | 5-10核苷酸 | 单核苷酸 |
A)琼脂糖凝胶
琼脂糖溶液加热并冷却后，就会形成凝胶基质，用于核酸电泳。由于琼脂糖凝胶加热可逆，因此，通过溶解含有目的片段的凝胶，可提取电泳分离出的核酸。
* 确定琼脂糖比例
通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。琼脂糖凝胶的含量与分离核酸大小成反比。
推荐百分比琼脂糖凝胶用于DN**段分离
| 凝胶百分比 | 0.5 | 0.6 | 0.7 | 0.8 | 0.9 | 1.0 | 1.2 | 1.5 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 5.0 |
|---|
| 高效分离的范围(bp) | 2,000-50,000 | 1,000-20,000 | 800-12,000 | 800-10,000 | 600-10,000 | 400-8,000 | 300-7,000 | 200-3,000 | 100-2,000 | 25-1,000 | 10-500 | 10-300 |
凝胶比例计算为:凝胶%(w/v)=(琼脂糖g/缓冲液ml)x 100%
* 用于核酸电泳的琼脂糖选型：
生化级琼脂糖适用于普通核酸电泳；
Wide range琼脂糖可用于分离碱基数量较低的DNA，约50-1000bp；
低熔点琼脂糖适用于DNA提取，也是凝胶内酶反应的理想选择；
低EEO琼脂糖，纯度更高，有助于和加快核酸条带电泳速度、减少条带扩散并提高电泳分辨率；
高分辨率琼脂糖可用于分离碱基数量差异在2%左右的小DN**段（20-800bp）。
琼脂糖
| 产品号 | 名称 | 级别 | Cas | 规格 |
|---|
| A104062 | 琼脂糖 | for biochemistry | 9012-36-6 | 5g,25g,100g,500g |
| A118882 | 琼脂糖 | Wide range(multipurpose) | 9012-36-6 | 5g,25g,100g |
| A118881 | 琼脂糖 | High resolution, DNase, RNase, NICKase, none detected | 9012-36-6 | 25g,100g |
| A118880 | 琼脂糖 | low EEO | 9012-36-6 | 5g,25g,100g,500g |
| A104063 | 低熔点琼脂糖 | 低熔点,适用于分离小的核酸片段 | 9012-36-6 | 5g,25g |
B)聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体聚合而成的聚合物，通常与双丙烯酰胺或N,N'-亚甲基双丙烯酰胺结合使用。 交联剂双丙烯酰胺含有两个单位通过亚甲基桥连的丙烯酰胺。 聚合是被TEMED催化（N,N,N,N-四甲基乙二胺）的自由基反应-通常由过硫酸铵(APS)引发。在既定温度下，APS和/或TEMED的浓度决定了聚合速率。
* 聚丙烯酰胺组分选型
核酸分离，通常采用 3–30% (%T)的聚丙烯酰胺凝胶。
%T(w/v)=[(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g/缓冲液ml]x 100%
%C(w/w)=[双丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g]x 100%
聚丙烯酰胺常用组分及应用
| 丙烯酰胺:bis | %C | 相对孔隙大小 | 研究应用 |
|---|
| 19:1 | 5% | 小 | DNA和变性凝胶 |
| 29:1 | 3.3% | 中 | 非变性凝胶中ssDNA和RNA |
| 37.5:1 | 2.7% | 大型 | 蛋白凝胶 |
* 确定聚丙烯酰胺比例
在凝胶中，丙烯酰胺和双丙烯酰胺(简称为“bis”)的总浓度(以%T表示)决定了孔隙大小。%T百分比越高，孔隙越小，可分辨的分子越小。
不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围表
| 丙烯酰胺（%） | 3.5 | 5.0 | 8.0 | 12.0 | 15.0 | 20.0 |
|---|
| 有效分范围(bp) | 100~2000 | 80~500 | 60~400 | 40~200 | 25~150 | 10~100 |
* 确定配方（以50ml体系为例：）
| 成分 | 丙烯酰胺：Bis | 10*TBE | TEMED | 10% APS | dd H2O |
|---|
| 浓度 | 目标浓度 | 总体积的1/10 | 0.5μl/ml | 5μl/ml | 补足体积 |
丙烯酰胺：双丙烯酰胺的组分-可预先制备成原液，方便使用。
丙烯酰胺：双丙烯酰胺为神经毒素，实验时应使用防护设施，小心操作。
聚丙烯酰胺凝胶组分
| 产品号 | 名称 | 级别 | Cas | 规格 |
|---|
| A108470 | 丙烯酰胺 | 电泳专用级 | 79-06-1 | 25g,100g,500g |
| M104026 | N，N′-亚甲基双丙烯酰胺 | 电泳级, ≥99.0% (T) | 110-26-9 | 25g,100g,500g |
| T105496 | 四甲基乙二胺(TEMED) | 用于电泳,99% | 110-18-9 | 25ml,100ml |
| A112447 | 过硫酸铵APS | 99.99% metals basis | 7727-54-0 | 25g,100g,500g |
电泳缓冲液
电泳缓冲液和凝胶制备缓冲液应尽量相同，确保有效的导电性。
电泳缓冲液的选择取决于样品大小、运行时间和后电泳过程，其中Tris-醋酸盐EDTA(TAE)和Tris-硼酸 EDTA(TBE)是最常用的两种缓冲液。
缓冲液选择指南
| 缓冲液 | 产品优势 | 缺点 | 核酸分辨率包装 |
|---|
| | | | DNA | RNA |
| TAE | ▪可更好地分离大片段
▪缓冲能力低；更适用于短时间运行
▪适合于下游的酶学应用 | ▪更容易导致过热 | ＞1,000bp | ＞1500 |
| TBE | ▪适用于短片段（线性dsDNA在TBE中迁移慢10%）
▪离子强度高、缓冲能力强；适用于长时间运行
▪不易导致过热 | ▪抑制酶，不适合下游酶学步骤（如克隆） | ＜5,000bp | ＜1500碱基 |
检测dsDNA和RNA，一般在变性琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的条件下进行。在缓冲液中加入变性剂会破坏核酸之间的氢键，减少二级结构的生成。常见的变性剂有：琼脂糖凝胶，磷酸钠缓冲液中的乙二醛和DMSO、NaOH- EDTA缓冲液、MOPS缓冲液中的甲醛或甲酰胺等；聚丙烯酰胺凝胶，TBE缓冲液中的尿素。
生物缓冲液
常见变性剂
| 产品号 | 名称 | 级别 | Cas | 规格 |
|---|
| F103362 | 甲酰胺 | 分子生物学级,≥99.5% | 75-12-7 | 100ml,500ml,2.5L |
| G103130 | 乙二醛溶液 | 用于分子生物学,40% in H2O(8.8 M) | 107-22-2 | 25ml,100ml |
| D103277 | 二甲基亚砜 | 分子生物学专用,≥99.9% | 67-68-5 | 250ml |
| U111901 | 尿素 | 电泳级,≥99.5% (T) | 57-13-6 | 500g,1Kg |
染料
核酸样品染色的两种常用方法，包括:1)凝胶内染色；2)电泳后染色。
凝胶内与电泳后染色的利弊
| 方法 | 优势 | 注意事项 |
|---|
| 凝胶内染色 | ▪更便利
▪工作流程更快
▪所需染色更少 | ▪在长时间运行后，染色可能会消失
▪染色剂只能使用一次
▪可能改变样品迁移性 |
| 电泳后染色 | ▪提供更精确的分子大小分析
▪允许重复使用染色液或多个凝胶同时染色 | ▪工资流程耗时长
▪所需染色剂较多
▪可能会产生较多有害物质 |
A）凝胶内染色
使用荧光核酸染色剂，是核酸内染色的常用方法。可在琼脂糖凝胶制备时加入推荐浓度核酸染色剂(常用溴化乙锭0.5 μg/mL)。
荧光核酸染色剂
| 产品号 | 名称 | 级别 | Cas | 规格 |
|---|
| E119045 | 溴化乙锭(EB) | 分子生物学级,粉末,≥95% (HPLC) | 1239-45-8 | 1g,5g,25g |
B）电泳后染色
电泳后染色常用银染方法对聚丙烯酰胺凝胶进行染色。
常规步骤如下：
（1）取下凝胶放入染色盒中用蒸馏水冲洗2次；
（2）固定：将胶放于固定液中振荡，固定10min；
（3）氧化：倒出固定液，水洗后用1%**氧化3min，用蒸馏水漂洗2次，每次2s；
（4）染色：放入银染液中避光染色30min；
（5）洗涤：蒸馏水漂洗15s；
（6）显色：放入显色液中显色；
（7〕停显：待有清晰条带出现（背景不太深时）倒出显色液，加入10%乙酸终止显色；
（8）水洗，成像。
固定液、染色液、显色液成分：
固定液：10%乙醇，0.5%乙酸
银染液：0.2%**银，用之前加200ul甲醛（250ml银染液中）
显色液：1.5%氢氧化钠，0.5%甲醛
银染相关试剂
